双荧光素酶报告基因系统概述

金年会金字招牌诚信至上所提供的双荧光素酶报告基因系统是一种广泛应用于生物医疗领域的技术，旨在研究基因表达调控、蛋白质相互作用及信号通路。自1990年问世以来，该技术经历了30多年的发展。1993年，首个萤光素酶专利获得批准，并于1996年推出了双荧光素酶报告基因检测系统，此后被广泛应用于各类研究。

该系统主要利用两种不同来源的荧光素酶：一种是来源于北美萤火虫（Photinus pyralis），另一种是提取自海洋腔肠动物海肾（Renilla reniformis）。前者生成的荧光素酶蛋白由550个氨基酸组成，分子量为62kDa，能够直接被检测，无需后期修饰（张菊梅等，2001）。后者，其分子量为36kDa，同样能够在转录翻译后立刻展现催化活性（赵斯斯，2012）。

实验原理

利用荧光素酶与底物结合的化学发光特性，研究者将目标基因的转录调控元件克隆至萤火虫荧光素酶基因的上下游，构建成荧光素酶报告质粒。细胞转染后，在适当刺激条件下裂解细胞，并测定荧光素酶活性，依此判断不同实验处理对目标基因调控元件的影响。为了提高实验结果的可靠性，使用Renilla荧光素酶质粒作为内参，以排除细胞生长状况、细胞计数及转染效率等因素的干扰。

实验步骤

1. 报告基因质粒构建：将目标片段插入荧光素酶表达的报告基因载体中。
2. 转染细胞：共同转染报告基因质粒及内参质粒，并培养48小时。
3. 细胞处理：根据实验需求对细胞进行相应处理。
4. 裂解细胞：加入裂解液以裂解细胞。
5. 测定荧光值：加入荧光素底物后测定荧光素酶活性。
6. 数据处理：计算相对荧光素酶活性并进行统计分析，如t检验或ANOVA，以评估组间差异的显著性。

应用场景

• miRNA与靶基因的相互作用研究：用于验证miRNA与mRNA、lncRNA及cirRNA的相互作。
• 转录因子与启动子的相互作用：探讨转录因子如何调控基因表达。
• 启动子活性分析：验证启动子的表达模式及强度。
• 启动子SNP分析：研究启动子区域的单核苷酸多态性及其对基因相对活性的影响。
• 细胞内信号通路的激活与传导：评估特定信号通路的反应情况。
• 药物筛选：进行高通量药物筛选，评估药物对基因表达的影响。

常见问题及解决方案

Q1：实验结果荧光值过高怎么办？

过高的荧光值可能超出仪器检测范围。可尝试减少转染质粒量，或对裂解后样品进行稀释处理。

Q2：实验结果不稳定或复孔间差异大，如何处理？

确保使用相同状态的细胞，优化转染条件，并准确加样以提高实验一致性。

Q3：荧光素酶的优势是什么？

相较于荧光蛋白，荧光素酶拥有更高的灵敏度和更宽的动态范围，适合数值分析比较，并且无需显微镜观察。

总结

金年会金字招牌诚信至上提供的双荧光素酶报告基因系统，在基因表达调控及信号通路研究中发挥着重要作用，优化的实验设计和数据分析 garantir 会为科研提供有力支持。