产品名称：pCR-BluntII-TOPO-ZNF541（人类）质粒

产品规格：05μg质粒干粉

产品使用说明

收到产品后，请根据产品管壁标签确认其形式，并在扩增前仔细查阅该质粒的抗性、感受态及培养温度。

质粒扩增流程

1. 质粒干粉（常温运输，存储于-20℃，保质期90天）
收到后请先进行5000rpm离心1分钟，之后加入20μl去离子水以溶解质粒；
取1支100μl感受态于冰上解冻10分钟，加入2μl质粒，然后在冰浴中放置30分钟，接着进行42℃热激60秒，注意不要搅动，最后再冰浴2分钟。（后续步骤均需在超净工作台内进行无菌操作）

2. 加入900μl无抗LB液体培养基，180rpm震荡培养37℃，持续45分钟；
3. 以6000rpm离心5分钟，保留100μl上清液，重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；
4. 将平板正向培养1小时，再倒置培养37℃，共计14小时。若需30℃培养，则延长至20小时。（如菌落过多，则应稀释质粒后再转化；如无菌落，则加入10μl进行菌落转化。）

5. 挑取单菌落入LB液体培养基中，加入相应抗生素，在220rpm下震荡培养14小时，并根据需要提取质粒。

其他产品形式

1. 甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天）
要求划线挑选单克隆培养；酵母菌需液体复苏后方可划线，再挑取单菌落进行液体培养。

2. 穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
接种穿刺后进行液体培养，再进行四区划线及单菌落挑取。

3. 菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
可直接挑取单菌落入液体培养基。

4. 液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
从单独提取的液体质粒可直接使用。

5. 滤纸质粒（常温运输，存于-20℃，保质期90天）
收到货后，将滤纸圈剪下放入EP管中，加入100μl无菌水浸湿，每次浸泡5分钟，提取5μl进行转化，并全涂。

质粒提取步骤

实验原理：碱裂解法通过共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异进行分离。在线性DNA解开的条件下，共价闭合的质粒DNA依旧保持完整。通过洗脱液的pH值恢复质粒DNA的稳定性，进而实现分离。

操作步骤：

1. 准备20ml灭菌培养管，编号后加入8ml LB培养基及相应抗生素；
2. 用10μl枪头挑取单个菌落入培养管，37℃震荡过夜；
3. 取2ml过夜培养液进行离心，去上清液；
4. 向含菌体沉淀的管中加入Buffer P1，充分混匀；
5. 加入Buffer P2，轻轻翻转混合，获取澄清裂解液；
6. 加入Buffer N3，混匀产生沉淀并离心；
7. 将上清转移至吸附柱，进行离心；
8. 加入Buffer PB清洗，离心；
9. 再加入Buffer PW清洗，空离一次；
10. 向吸附柱中加入Buffer EB静置后离心；
11. 将液体倒回吸附柱，再离心；
12. 加入合适的缓冲液，标记冷藏保存。

注意事项

1. 使用前需将RNA酶加入Buffer P1，保持在4°C。
2. 预热Buffer EB至65~70℃，以提高提取效率。

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